پت شاپ پرشین پت
Follow Us
facebook twitter blog google

خبر های روز حیوانات خانگی

  • اسباب‌بازی‌های گهواره‌ای به شکل هیولا ◄ اسباب‌بازی‌های گهواره‌ای به شکل هیولا
      اسباب‌بازی‌های گهواره‌ای به شکل هیولا طراحی شده‌اند تا تعادل کامل را حفظ کنند و بدون خطر واژگونی، ریتم تاب خوردن بهینه را امکان‌پذیر می‌سازند. Rocking Monsters ساخته کنستانتین بولیموند شبیه کوسه ها و دیگر موجودات دریایی است. آنها یک سواری راحت را برای بچه ها در هر اندازه ای فراهم می کنند. ایمنی اولویت اول است. هر هیولای گهواره ای به طرز ماهرانه ای از نظر وزن و نسبت های فیزیکی متعادل است. طراحی شده و ارگونومیک برای کودکان با قد 3 فوت و بالاتر. این اسباب‌بازی‌های چوبی سرگرم‌کننده با گوشه‌های گرد، سطوح صاف، و پرداخت صیقلی، ساعت‌ها بازی بدون نگرانی را برای کودکان فراهم می‌کنند.
  • خانه گربه مدرن ◄ خانه گربه مدرن
      خانه گربه مدرن با گوشه های گرد و رنگ سیاه سرد به عنوان فضایی عالی برای استراحت، بازی و پنهان شدن گربه شما عمل می کند. خانه گربه "Retro Box Black" ساخته شده توسط PurrFur از تخته سه لا با کیفیت بالا. تخت گربه دارای یک بالشتک نرم است تا یک مکان خواب راحت و یک مخفیگاه بازیگوش برای گربه های خجالتی فراهم کند. طراحی لبه های گرد به آن اجازه می دهد تا به طور یکپارچه با دکوراسیون منزل شما ترکیب شود. PurrFur Cat House کاملاً مونتاژ شده وارد می‌شود، در وقت شما صرفه‌جویی می‌کند و اطمینان حاصل می‌کند که گربه شما می‌تواند فوراً در مکان دنج جدید خود شیرجه بزند.
  • مبلی برای انها که گربه دارند ◄ مبلی برای انها که گربه دارند
      مبل مدولار ساخته شده از بخش های مختلف دارای محفظه های ذخیره سازی و قسمت های اختصاصی برای کاوش یا استراحت گربه شما است. مبل توری مفهومی طراحی شده توسط استودیو مبلمان SUNRIU مستقر در تایوان. خطوط تمیز و طراحی متفکرانه مبل توری را به انتخابی هوشمندانه برای کسانی تبدیل می کند که به دنبال سادگی هستند بدون اینکه سبک یا کارایی را به خطر بیندازند. قاب چوبی پوشیده شده با روکش پارچه ای نرم و ظریف به این مبل کمک می کند تا به راحتی در هر فضایی قرار گیرد. صاحبان آینده قادر خواهند بود بخش‌ها و ماژول‌های مبل را جابه‌جا کنند تا چیدمان صندلی‌های چند منظوره ایجاد کنند. انسان‌ها می‌توانند کتاب‌ها، گیاهان داخل خانه و اقلام کوچک را در قفسه‌های مختلف که توسط طراحی SUNRIU در کناره‌های مبل توری ادغام شده‌اند، ذخیره کنند.
  • مبل برای گربه ها ◄ مبل برای گربه ها
      مبل مدولار پوشیده از بافت پارچه زرد که شبیه خز نرم گربه است دارای یک تکیه گاه راحت با تونل گرد یکپارچه برای عبور گربه است. مبل راهرو طراحی شده توسط SUNRIU یک مبلمان مدرن برای صاحبان حیوانات خانگی است. اگر حیوانات خانگی کوچکی در خانه دارید، آنها تونل داخلی را که فقط برای آنها طراحی شده است، دوست خواهند داشت. مبل جالبی که هم برای شما و هم برای گربه شما ساخته شده است! چه یک آپارتمان استودیویی یا یک خانه بزرگ داشته باشید، طراحی مدولار کاناپه Aisle به طور یکپارچه با هر اتاق نشیمن سازگار است. پس از یک روز طولانی، وقت خود را با گربه خود روی این مبل بگذرانید و اجازه دهید بافت پارچه ای نرم آن شما را به بهشت آرامش ببرد.
  • بسته بندی عسل غیرمعمول ◄ بسته بندی عسل غیرمعمول
      بسته بندی عسل غیرمعمول شبیه سر چوبی لگوی زنبوردار است که با توری محافظ پوشانده شده است. "عسل زنبوردار" توسط Busy Bee برای Ergastiri Meliou طراحی شده است. عسل آویشن نفیس در بسته بندی هوشمندانه که ضیافتی برای چشم است. در داخل جعبه، 250 میلی لیتر عسل آویشن یونانی خالص را در یک ظرف شیشه ای خواهید دید که با یک برچسب شیک با طراحی مدرن تکمیل شده است. جعبه ساده به چیزی غیرمنتظره و عجیب تبدیل شده است، در حالی که یک هدف عملی در محافظت از شیشه عسل دارد. بسته بندی خلاقانه عسل یک عنصر شگفت انگیز و لذت را به ارائه کلی اضافه می کند و آن را به یاد ماندنی و متمایز می کند.
  • مبلمان مدرن گربه‌پسند ◄ مبلمان مدرن گربه‌پسند
      مبلمان مدرن گربه‌پسند به‌طور یکپارچه میز قهوه‌خوری چوبی را با بانوج گربه‌ای که در زیر آن تعبیه شده است، ترکیب می‌کند. میز Kikko که توسط LABBVENN برای لذت انسان و گربه طراحی شده است، یک مکان استراحت راحت برای گربه شما ارائه می دهد. میز قهوه خوری مینیمالیستی، غنی شده با عناصر فلزی و یک بانوج پارچه ای لحافی، فضایی شیک و کاربردی را برای دوست پشمالوی شما فراهم می کند. بانوج گربه که در چهار رنگ موجود است، به راحتی برای شستشو قابل جابجایی است و مکانی تمیز و دلپذیر برای خواب و آرامش گربه را تضمین می کند.
  • حیوانات خوردنی ◄ حیوانات خوردنی
      حیوانات، هیولاها، موجودات عجیب و غریب و آثار هنری خوراکی ساخته شده از غذا. هنر خلاقانه غذایی توسط هنرمند بصری مستعد لندن هلگا استنتزل.
  • خانه گربه مدرن ◄ خانه گربه مدرن
      خانه گربه مدرن با گوشه های گرد و رنگ سیاه سرد به عنوان فضایی عالی برای استراحت، بازی و پنهان شدن گربه شما عمل می کند. خانه گربه "Retro Box Black" ساخته شده توسط PurrFur از تخته سه لا با کیفیت بالا. تخت گربه دارای یک بالشتک نرم است تا یک مکان خواب راحت و یک مخفیگاه بازیگوش برای گربه های خجالتی فراهم کند. طراحی لبه های گرد به آن اجازه می دهد تا به طور یکپارچه با دکوراسیون منزل شما ترکیب شود. PurrFur Cat House کاملاً مونتاژ شده وارد می‌شود، در وقت شما صرفه‌جویی می‌کند و اطمینان حاصل می‌کند که گربه شما می‌تواند فوراً در مکان دنج جدید خود شیرجه بزند.
  •  بسته بندی عسل ◄ بسته بندی عسل
      عسل خوشمزه، شهد طلایی طبیعت، بسته بندی شده در بطری با طراحی خلاقانه شبیه لانه زنبوری که چکه می کند. MEL Meadow Honey Wildflower سمفونی از طعم ها است که از شهد گل های وحشی متنوعی مانند گل ذرت، شبدر و نمدار ساخته شده است. ترکیب عسل نفیس که جوانه های چشایی شما را وسوسه می کند و به عنوان منبع طبیعی آنتی اکسیدان ها عمل می کند. بسته بندی عسل مل که توسط کنستانتین بولیموند طراحی شده است یک شاهکار واقعی است که ذات نعمت طبیعت را به تصویر می کشد. بسته بندی بطری الهام گرفته از لانه زنبوری فقط یک ظرف عسل نیست، بلکه بیانیه ای از لذت خالص و طلایی است. طراحی زیبا انتظار طعم خارق‌العاده عسل را ایجاد می‌کند و مصرف‌کنندگان را مجذوب می‌کند تا طعم و مزه عسل مل را تجربه کنند.
  • گهواره ای برای گربه ◄ گهواره ای برای گربه
      تخت بانوج راحت برای گربه شما که برای نصب زیر صندلی معمولی یا زیر میز طراحی شده است. گهواره ابداعی گربه فضای بلا استفاده خانه شما را به تختی نرم برای حیوان خانگی مورد علاقه شما تبدیل می کند. موجود در رنگ های مختلف. گاوصندوق ماشین لباسشویی. [سفارش]
12345678910بعدیآخرین
(1 - 10) / 29320    |     صفحه 1 از 2932
RSS

GetPagedList: 0,440,,False,False,False,CreationDate,0,10

معرفي نژاد گربه


اخبار ومقالات - گالری


نمایش متن مقالات

بیماری آنفولانزای مرغی

یماری آنفولانزای مرغی


(قسمت سوم)





شیوع ویروس آنفولانزای A,H5N1 در هنگ كنگ در سال 1997 ، 6 نفر از 18 نفری را كه عفونی شده بودند از بین برد و اولین مورد مستند انتقال مستقیم ویروس آنفولانزای مرغی از طیور به انسان بود .
شیوع منجر به گسترش بیماریهای جدی كشنده شد و بعضی به آن بعنوان نخستین حالت پاندمیک اشاره میكنند .
كشتار تمام طیور در فروشگاه های فروش طیور زنده در هنگ كنگ در دسامبر 1997باعث از بین رفتن منبع عفونت و جلوگیری از انتقال بیشتر به انسانها شد. ویروسهای H5N1 انسانی جداشده (/97 H5N1 ) تصور می شود كه بطور طبیعی از نوترتیبی ویروس های مرغی پدید آمده اند كه ژن ( HA ) هماگلوتینین بسیار با این ژن در ((A/goose/Guangdong/1/97(H5N1))) همولوگ می باشد و كمپلكس همانند ساز آن بمیزان زیادی با كمپلكس مانند ساز یروسهای (H9N2)A/guail/Hongkong/GI/97,(H6N1)Alteal/Hongkong/W312/97 مشابه می باشد.
ژننورآمینید از (NA ) ویروس H5N7/97 همچنین بطور نزدیک با این ژن در ویروس Alteal/Hongkong/W312/97 همولوگ می باشد.
در طول سالهای 1999 و2000ویروسهای H5N1 شبه GO/Gd به خرچه زندگی خود در غازها درجنوب غربی چین ادامه دادند. این ویروسها با ویروسهای با منشاء مرغان آبی نو تركیبی داشتند و ژنوتیپهای چندتایی ویروسهای H5N1 حاوی ژنهای NA,HA از ویروسهای شبه GO/Gd در فروشگاه های طیور هنگ كنگ بین فوریه وMay 2001 دوباره ظاهر شدند.
این ظهور دوباره ویروسهای H5N1 در پرندگان خاكی اولین بار بود كه بعد از اپیدمی دسامبر 1997 رخ می داد و منتج به دومین میزان تلفات در طول 4 سال زندگی طیور درهنگ كنگ خصوصاً‌ در ناحیه اجرائی گردید. تمام ویروسهای H5N1 جدا شده از طیور در فروشگاههی خرده فروش طی زمستان و بهار 2001 نو تركیبهایی بودند كه حاوی ژنهای NA,HA در درمان GO/Gd وژنهای داخلی دیگر ویروسهای مرغان آبی بودند .
5 نوع از نوتركیب ها با ژنوتایپهای طراحی شده A,B,C,D,E مشاهده شدند و با توجه به منشأ فیلوژنی و ساختار ژنهای داخلی گروه بندی شدند. ویروسهای تمام 50 ژنوتیپ شدیداً‌ برای جوجه ها و بلدرچین ها بیماریزا بودند همچنین تمام 5 ژنوتیپ برای موش هنگامی كه با دوز بالا با ویروس عفونی تلقیح می شدند كشنده بودند. ویروسهای 4تا از 5 ژنوتیپ از مغز موشهایی كه علائم اختلال سیستم عصبی مركزی CNS را داشتند جدا شد. پاتوژنیسته ویروس آنفولانزایA در موش معمولا نیاز به آداپته شدن با میزبان جدید، كه طی رشد چند نسل پی در پی « پاساژهای پشت سرهم » ویروس در مغز یا ششها رخ می دهد .
مطالعه كسب بیماریزایی در طول آداپته شدن در موش نشان داد كه ویروسها آداپته شده با موش كه پنموویرولانس و نوروویرولانس هستند نشان داده كه با موتاسیون در NS,M,NA,NP,HA یک یا ده تا از ژنهای پلی مراز همراه می باشد .
برخلاف دیگر ویروسهای آنفولانزای A مرغی و انسانی، سویه های مرغی و انسانی هنگ كنگ H5N1/97 جدا شده دارای پاتوژنیسته درموش می باشند بدون آداپته شدن. ویروسهای H5N1/97 در پاتوژنسیته برای موش هتروژنوس هستند: تعدادی از جداشده ها بسیار بیماریزا بودند و بصورت سیستمیک تكثیر می كردند در حالی كه دیگران دارای بیماریزایی كمتری بودند و در دستگاه تنفسی تكثیر می كردند. پاتوژنز ویروسهای H5N1/97 در موش ازدیگر ویروسهای شدید غیرپاتوژن H5 متمایز می باشد و شمای ملكولی فتوتیپهای H5N1/97 كه در موش بسیار پاتوژن هستند تعیین شده اند. بعلاوه، Hatta و همكارانش با استفاده ازتكنیكهای معكوس ژنتیكی بر پایه پلاسم یدنشان دادند كه وجود یک لیزین در بنیان 627 در پروتئین PB2 و یک محل شكست پلی بازیک در HA برای بیماریزایی شدید و تكثیر سیستمیک ویروس (H5N1)A/Hongkong/483/97 در موش قطعی می باشد .
پاتوژسیته فتوتپهای كمو بسیار پاتوژن در یک مدل موش صحرائی عقیم مورد مطالعه قرار گرفته است: هر دو فتوتیپ شدیداً در موش صحرائی بیماریزا بودند بر خلاف بیماریزایی متفاوتی كه درموش دیده میشد .
پاتوژنسیته ویروس (H5N1 ) A/Hongkong/156/97 انسانی مورد مطالعه قرار گرفت. این ویروس بطور كارآمد در دستگاه تنفسی تكثیر می كند وقطعات ژنی بوسیله PCR در مغز و تعدادی ارگانهای داخلی عفونی شده تشخیص داده شدند اما هیچ گونه تكثیر سیتسمیک در این ویروس مشاهده نشد .
در مطالعات فعلی، از یک مدل موش برای تعیین خصوصیات پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1 2001 هنگ كنگ در میزبانهای پستاندار استفاده شد. ویروسهای 4 ژنوتیپ از 5 ژنوتیپ بعد از تلقیح به داخل بینی از مغز موش جدا شدند. ما بیماریزایی را برای موش و شمای ملكولی این واریانت های نوروپاتیک موجود در مغز موش (MB) را با ویروس جدا شده با منشاء H5N1/01S را مقایسه كردیم نتایج دال برتاثیر ژنهای داخلی بر روی پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 مرغی در میزبانهای پستاندار و احتمالاً انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن و نورویرولانت می باشد .

ویروسها :
ویروسهای 5 نوع H5N1 مرغی ، از هر 5 ژنوتیپ كه در بهارسال 2001 در هنگ كنگ جدا شدند در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند.
Genotype A,A/chicken/Hongkong/yu822.2/2001(ch/hk/yu822.2/01)
Genotype B,A/chicken/Hongkong/yu562/2001(ck/hk/yu562/01)
Genotype C,A/pheasant/Hongkong/Fyl55/2001(ph/HK/Fy155/01)
GenotypeE ,A/Chicen/Hongkong/NT87303/2001(CK/HK/NT87303/01).
ویروسها بوسیله یک پاساژ درجنین تخم مرغ جدا شدند. برای آماده سازی استوكها برای مطالعه در موش، ویروسها قبلابرای یک بار بیشتر در حفره آلانتوئیک جنین 10 روزه جوجه برای 48تا40 ساعت در دمای c370 پاساژ داده شدند .
مایع آلانتوئیک حاوی ویروس خالص سازی شدند و میزان عفونت زائی آنها در تخم مرغ ها تیتر شد. تیترهای ویروس بعنوان log10 -50% از دوز عفونی كننده تخم مرغ در ml1/0 از مایع بیان می شد. (log10 50% EID50 per0.1 ml) باتوجه به متد. Reed , Muench استوكهای ویروس به دو دسته زنده و تازه و دسته نگهداری شونده در 80- تا موقع مصرف تقسیم بندی شدند .
تمام مطالعات با ویروسهای H5N1 درسطح +3 ، Biosafty انجام گرفت آزمایشگاه توسط بخش كشاورزی ایالت متحده در اختیار محققین گذارده شد.

بیماری زائی وتمایل بافتی ویروس H5N1 اصلی جدا شده از موش :
موش ماده 5/1 ماهه BALB/C برای این مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند. برای تعیین 50% دوز كشنده در موش ( MLD50) ، 4گروه ازموشها بوسیله استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدند و با ml 1/0 از مایع آلانتوئیک در سالین بافرفسفات بصورت تلقیح داخل بینی عفونی شدند (PBC ) « 10 رقت پشت سر هم از تا حیوانات روزانه وزن شدند و برای 20 روز تحت نظر گرفته شدند .
تیتراسیون MLD50 نشان داد كه تمامی 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1/01 از گروه دارای پاتوژنسیته كم در موش بودند به همین دلیل آنها بطور قابل توجه ای ایجاد بیماری و مرگ و میر فقط در روز بالا ایجاد می شد .
بدلیل اینكه ویروسها دارای ارزشهای EID50 مشابه بودند مارقت از مایع آلانتوئیک را كه حاوی تقریباً از ویروس به عنوان دوز عفونی برای مطالعات بیشتر بر روی پاتوژنسیته انتخاب شدند. گروههای 18 تا 26 موش ها با ml 501 از مایع آلانتوئیک رقیق شده با PBS بصورتداخل بینی مورد تلقیح قرار گرفتند.
3 موش از هر گروه در روزهای 3و7 بعد ازتلقیح برای تعیین تیتر ویروس در ریه كشته شدند « روز 3 » و در مغز و ارگانهای داخلی « روز 3و7» .
موش باقی مانده در هر گروه بصورت روزانه وزن شدند و برای 20 روز تحت جهت مشاهده علائم بیماری و مرگ و میر تحت نظر گرفته شدند .
شش ها، مغز، طحال، كبد، كلیه و قلب هر موش مرده یا حیواناتی كه مرحله پایانی بیماری كشته می شدند خارج شدند. ارگانها در PBS سرد شسته شدند، وزن شدند، له شدند و در PBS سرد با آنتیبیوتیكها برای به دست آوردن یك هموژن 10% هموژنیزه شدند. ناخالصی های نمك بوسیله سانتریفیوژ كردن در z,000 g برای 10 دقیقه ته نشین شدند .
بافت هموژن نشده به درون حفره آلانتوئیک جنین 10 روزه تخم مرغ تشخیص محدوده پائین تر ویروس 0.1log10 EID-DO/0.1ml از بافت هموژن می باشد .
3
تا 7 روز بعد از تلقیح هیچ ویروسی در مغز یا ارگانهای داخلی موش قابل تشخیص نبود. لیكن ویروس در مغز و ارگانهای داخلی موش كه علائم نورولوژیک را نشان می داد 8 تا10 روز بعد از تلقیح قابل تشخیص بود « بطور عمده فلج پای عقب»
نتایج بررسی پاتوژنسیته وبافت گرایی 5 ژنوتیپ H5N1/01 را به سه گروه تقسیم می كند:
گروه اول شامل ویروسهای ژنوتیپهای A,B هستند كه ابتدا در ریه های موش همانند سازی می كنند. عفونی شده با ویروس CK/HK/YU822.2/01 ، ویروس ازشش ها، مغز و ارگانهای داخلی جدا شده ویروس به میزان كافی در مغز این حیوان همانند سازی كرده بود. تیتر ویروس CK/HK/YU822.2/01در كبد، طحال وكلیه خیلی پائین بود .
«ویروس فقط از بافت هموژن رقیق نشده جدا شد .» ویروس ژنوتیپ B فقط درششهای موش عفونی قابل تشخیص بود. عفونت با این ویروس باعث 55% مرگ و میر گردید.
گروه دوم متشكل از فقط یك عضو بود . ph/HK/FY155/01 ( ژنوتیپ c) ، كه در شش ها و مغز عفونی موش همانند سازی می كند .
عفونت با این ویروس منتج به بیشتر میزان مرگ و میر گردید. این ویروس از مغزهای موش كه دارای فلج پیشرفتهای عقبی بود وتلف شده بود یا اینكه در روزهای 7تا10 بعد از تلقیح كشته شده بود جدا شد. 29% از حیوانات تلف شده « 7/27 % از عفونی ها » دارای ویروس در مغز بودند .
ویروس ژنوتیپ c در ششها و مغز موش با تیتر مشابه ای، كه حداكثر میزان را نسبت به بقیه ژنوتیپ ها داشته مانند سازی كردند.
گروه سوم، شامل ویروسهای ژنوتیپ D,E كه همچنین در شش ها مغز موش عفونی تكثیر می كنند باشد اما بیشتر از ژنوتیپهای دیگر نوروتروپیک هستند، تمامموشهایی كه بعد عفونی شدن بااین ویروسها مردند دارای ویروس در مغز بودند. نرخ مرگ و میر موش عفونی شده با CK/HK/FY150/01 « ژنوتیپ D »
و CK/HK/NT873.3/01بترتیب 5/61% و 3/33% می باشند. موش های عفونی شده با ویروسهای ژنوتیپ E,D دچار فلج پای عقبی، paresis , tremors قبل از مرگ در 10 تا 14 روز بعد از تلقیح می شدند .
پاتوژنسیته و تمایل بافتی واریانت های H5N1 جدا شده از مغز موش :
واریانتهای نوروتروپیک ویروسهای اصلی ژنوتیپهای A,C,D,E « واریانت MB» از مغز بوسیله كشت مغز هموژن ویروس مثبت در تخم مرغ جنین دار 10 روزه با یک با پاساژ جدا سازی شدند .
ارزش EID50 , MLD50 همانطور كه در بالا شرح داده شد تعیین گردید. برای مطالعه پاتوژنسیته و تمایل بافتی، گروههایی متشكل از 4 حیوان بصورت درون بینی با ml 1/0 ازمایع آلانتوئیك رقیق شده باPBC حاوی تا از ویروس عفونی مورد تلقیح قرار گرفتند .
مغز، شش ها و ارگانهای داخلی موش كه مرده بود یا در مرحله پایانی بیماری كشتهشده بود خارج شدند .
واریانت های CK/HK/YU822.2/01 , MB, Ph/HK/FY155/01 –MB, CK/HK/FY150/01 –MB , CK/HK/NT87303/01 –MB طراحی شدند بطور قابلتوجه ای ازویروسهای اصلی بیماریزا تر بودند. این واریانت ها ارزش MLD50 مشابه با ارزش EID50 آنها داشت كه دلالت بر پاتوژنسیته بالای این ویروسها برای موش دارد. واریانت های MB با توجه به تمایل بافتی شان در یكی از دو گروه قرار می گیرند.
گروه اول شامل واریانت های با پاتوژنسیته بالا از ژنوتیپهای A,C می باشد كه بصورت سیستمتیک تكثیر پیدا می كنند و مغز و ارگانهای داخلی را عفونی می سازند. دوزهای بسیار عفونی كنندهاز این واریانت های MB منتج به مرگ در روزهای 3و5 شده، ‌دوزهای پایین تر موشها را 6تا 11 روز بعد از تلقیح می كشد. تلقیح با دوزهای تا از هر دو ویروس سبب ایجادعلائم نورولوژیک مانند فلج پاهای عقبی، tremor , paresis گردید.
تیتر ویروس واریانت MB از ژنوتیپ های A,C در كبد و طحال و كلیه وقلب حداقل log102 تا 5/3 پایینتر از تیتر آنها در شش ها و مغز بود، جایی كه واریانت ها بطور كافی همانند سازی میكنند. این نتیجه پیشنهاد می كند كه این واریانت ها ی MB پنموتروفیک و نوروتروفیگ هستند .
گروه دوم شامل واریانت های MB از ژنوتیپ E,D هستند كه فقط در شش ها ومغز موش های عفونی تشخیص داده شده اند .
واریانت ژنوتیپ D موش را 4تا8 روز پس ازتلقیح می کشد و میزان EID5025/1 10از وریروس عفونی باعث فلج پاهای عقب و Paresis درروز هشتم بعد از تلقیح می شود. واریانت MB از ژنوتیپ Dدر شش ها و مغز تمامی موشهای مرده یا كشته شده تشخیص داده شدند .
پاتوژنسیته CK/HK/NT873.3/01- MB « ژنوتیپمشابه با واریانت ژنوتیپ D می باشد، بیشتر حیوانات در روز نهم مردند وعلائم نورولوژیک در موش عفونی شده با دوزهای 25/3 10 و 25/2 10 و 25/1 10 EDI56 مشاهده شد . ویروس ژنوتیپ E از شش و مغز هر حیوان تلف شده یا كشته شده جدا شد. تیترهای واریانت های ژنوتیپ درشش ها و مغز مشابه بودند .

بررسی هیستوپاتولوژیک :
با تغییرات لوكالیزه پاتولوژیک در CNS باعث بروز علائم نورولوژیک می گردد، نمونه های مغز وطناب نخاعی موش عفونی شده با CK/HK/YU822.2/02 – MB
« ژنوتیپو موشهایی كه درمرحله پایانی بیماری از بین رفتند در بافر خنثی فرمالین 10% فیكسگردیدند، در واكسن پارافین تثبیت شدند، برشهای 5 زده شدند، با هماتوكسیلین وائوزینرنگ شدند و برای تغییرات هیستوپاتو لوژیكال مورد ارزیابی قرار گرفتند.
دژنره شدن نرونها و نوروفاژیا با التهاب در اثر فیلتر نشدن گلرانولوسیتها و سلولهای مونونوكلوئر به ناحیه ساقه مغز و طناب نخاعی محدود می شد .
انفیلتراسیون سلولهای منونوكلوئر همچنین در مننژها و در فضاهای Prevascular ساقه مغز و neuropil طناب نخاعی دیده میشود .
در طناب نخاعی، همچنین یک دژنره شدن معمول سلولهای گلیال را داریم و نرونهای با كروماتین های حاشیه ای و یک انكلوژن ائوزینوفیلیک كه به طور نسبی یاكاملا هسته را پر می كند. دژنراسیون نرونی و انفیلتراسیون التهابی همچنین درتعدادی از ریشه های dorsal گانگلیا مشاهده شد و تعداد زیادی از كانونهای نكروزهو سلولهای التهابی به همراه بافت تخریب شده مشاهده گردید.

مرفولوژی پلاک :
یكی از خصوصیات مهم ویروسهای آنفولانزا در توانایی تشكیل پلاک در سلولهای كشت داده شده می باشد. همانند پاتوژنسیته، این خصوصیت می تواند طی انتخاب شدن درموش تغییر پیدا كند. مرفولوژی پلاک می تواند منعكس كننده هتروژنسیتی جمعیت ویروسی باشد . ارزیابی پلاک در سلولهای MDCK همانطوری كه در قبل شرح داده شد انجام می گیرد. ویروسهای با منشاء ژنوتیپ های A,B,C,D تشكیل پلاكهای بزرگ را كه بخوبی قابل تشخیصمی باشد می دهند كه این از خصوصیات ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن می باشد. ویروس ژنوتیپ ( CK/HK/NT873.3/01 ) E پلاكهای كوچک و كدر را تشكیل میدهد.
پلاكهایی كه بوسیله ویروسهای با یك منشاء تشكیل می شود هموژنوس بودند.پلاكهایی كه بوسیله واریانت های MB تشكیل می شدند بزرگتراز آنهایی بودند كه بوسیله منشاء تشكیل می شد و واریانت MB ژنوتیپ (CK/HK/NT873.3/01 – MB ) پلاكهایی را تشكیل می دهند نسبت به پلاكهای ویروس منشاء بهتر شناسایی شده است . هیچ پلاكی مانند آنهایی كه بوسیله واریانت های MB در سلولهای MDCKعفونی شده با ویروس های منشاء مشاهده می گردد تشكیل نمی شود .
افزایش مشابه دراندازه پلاک در واریانت های MB ژنوتیپهای C,D مشاهده گردید .
مقایسه توالی های ویروسهای منشأ و واریانت های MB مطالعات در موش نشان می دهد كه تلقیح منشاء ویروسهای H5N1/01 جداسازی شده ازژنوتیپ های A,C,D,E درموش منتج به انتخاب واریانت های بسیار پاتوژن و عصب دو ست میشود. با مقایسه تمام ملكول ایزوله های منشاء و واریانت های MB و تعیین اساس ملكولیب یماریزای در موش وتمایل به عصب، تمام ژنهای پدید آورنده واریانت های MB تعیین توالی شدند .
RNA
ویروسی از مایع آلانتوئیک حاوی ویروس با استفاده از RNeasyminikit جدا سازی شد. پرایمر uni-12 برای نسخه برداری معكوس مورد استفاده قرار گرفت .
PCR با دسته ای از پرایمرهای عمومی كه برای قطعات ژنی ویروسهای آنفولانزای A اختصاصی می باشد انجام شد . محصولات PCR با كیت خالص سازی سریع PCR (QIA ) خالص سازی شدند. عملیات تعیین توالی و بررسی نمونه ها در مركز بیوانفورماتیک و بیوتكنولوژی Harwell در بیمارستان تحقیقاتی كودكان St.Jvde انجام گرفت. تعیین توالی DNA كامل شد، و پیرایش شد، ترجمه گردید و با استفاده نرم افزار بررسی توالی بهنام Lasergene بسته بندی گردید .
بررسی فیلوژنیک توالی های كل ژنوم از ژنهایواری انتهای MB H5N1/0 ، ویروس منشاء و CK/HK/YU562/01 ( ویروس ژنوتیپ B كه از مغز موش جدا نشده بود) نشان داد كه ایزوله های منشاء دارای همان پراكندگی مشابه 5ژنوتیپی هستند همانطوری كه قبلاً براساس تعیین توالی نسبی توالی مشاهده شده بود .
واریانت های متمایل به عصب جدا شده از مغز موش متعلق به دسته مشابه ای ازژنوتیپها بود همانطوری كه در ابتدا در موش به طریقه داخل بینی تلقیح شده بود.
تغییرات توالی های آمینواسیدی بین ویروس های original و واریانت های MB آنها با آنهایی كه بین فنوتیپهای موش H5N1/97 انسانی با پاتوژسیته بالا و پایین یافت میگرد مقایسه گردید. تغییرات آمینواسیدی در واریانت های بسیار پاتوژن در تمام محصولات ژنی وجو داشت بجز پروتئین های NS1,NP,PB1 بیشترین تغییرات ویروسهایoriginal رااز واریانت های MB متمایز می ساخت ، همانطور كه از دیگر ویروسهای باپاتوژنسیته بالاو پایین تمایز می ساخت و آنها منحصر به فرد نبودند. طبیعت اتفاقی اینتفاوتها پیشنهاد می گردد كه ویروسها هتروژنوس هستند و دلالت می كند براینكه احتمال انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن وجود دارد .
این پیشنهادات بوسیله هتروژنسیته توالی های original از ژنهای PA,PB2 تاییدمی شود بخصوص در ژنوتیپهای A,C,D . واریانت MB از ژنوتیپ A(CK/HK/YU822.2/01 – MB ) از ویروس original بوسیله تغییرات منحصر به فرد در بنیان 738 در PB2 پلی مراز ، بنیان 10 و 212 در PA پلی مراز ، بنیان 50 در HA وبنیان 86 در NS2 و بوسیله حذف 20 آمینواسید و جانشینی G بهجای S70 در NA متمایز شدند. واریانت MB از ژنوتیپ C دارای 4 آمینو اسید منحصر بهفرد بودند كه در موقعیت های 305 و 307 و 627 در PB2 و در موقعیت 501 در PA درواریانت MB از ژنوتیپ D یک جانشینی منحصر به فرد در بنیان 97 در PA وجود دارد درحالیكه واریانت MB از ژنوتیپ E دارای چنین تغییراتی نبود. این موتاسیونهای منحصربه فرد ممكن است در اكتساب بیماریزای بالا و بیماری زای برای عصب در واریانت های MB دخیل باشند .
عدم وجود چنین تغییرات منحصر به فردی در واریانت MB از ژنوتیپ E میتواند در ابتدا بوسیله نوروتروپیسم بالا و بیماریزائی پایین ویروسهای original جدا شده از موش شرح داده شود. تغییرات متعاقب در واریانت MB ممكن است دارای اثربیماریزائی داشته باشد ولی اثر نورویرولانس ندارد.
ویروسهای H5N1 هنگ كنگی مرغی و انسانی كه در سال 1997 جدا شده اند دارای ژنوتیپهای مشابهی هستند :
هتروژنیستی پاتوژنسیته آنها در موش نتیجه یک اختلاف كوچك در توالیهای ژنومهایویروسی بود. در مقابل ویروسهای H5N1 جدا شده از فروشگاههای طیور هنگ كنگ در سال 2001 از 5 ژنوتیپ مختلفی كه به طور طبیعی وجود داشتند بودند . این ویروسهای H5N1/97 و H5N1/01 به طور معمول فقط دارای ژن NA « كه از نظر فیلوژنیكی نزدیک به ویروسهای شبه GO/Gd می باشند » ویروسهای شبه GO/Gd كه در سال 1999 در هنگ كنگ جدا شدندجد ژنهای HA,NA و تعدادی از ژنهای درونی ویروسهای H5N1/01 بودند كه نشان داده شده دارای بیماریزایی كمی درموش بوده هستند: این ویروسها به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كردند و فقط یكی از آنهایی كه جدا شدند و مورد مطالعه قرار گرفته اندبه میزان خیلی كم در مغز ردیابی شده اند مافهمیدیم كه بیشتر ویروسهای H5N1/OS original همانند ویروسهای H5N1/99 شبه GO/Gd دارای پاتوژنسیته كمی در موش بودند وبهبافت عصب نیز تمایل داشتند. لیكن بر خلاف ویروسهای شبه GO/Gd ویروسهای H5N1/01 چهاتار از 5 ژنوتیپ A-E در مغز موش قابل تشخیص بودند. زخمهای اختصاصی ویروس در ساقهمغز وطناب نخاعی وجراحات التهابی ریشه های بالایی گانگلیا دلالت می كند بر اینكهاین واریانتهای MB نوروتروپیک از ششها به مغز به طریق انتقال سیناپسی بوسیله اعصاب حسی منتشرمی شوند. یک مسیر انتقال عصبی ویروس هم همچنین در موش عفونی شده باویروسهای مرغی H5N3 كه درجوجه ها اداپته و بسیار بیماریزا شده بودند، مشاهده شد.ویروس ژنوتیپB به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كنند و سبب مرگ ومیر میشوند. اما درمقابل ویروسهای ژنوتیپ A,C,D,E ویروس ژنوتیپ B از مغز جدا نشد. تلقیح موش با واریانتهای MB جدا شده از مغز نشان می دهد كه این واریانتهادر موش بسیاربیماریزا هستند وحداقل دارای بیماریزای مشابه در موش هستند همانطور كه ویروسهای H5N/97 با فتوتیب بسیار بیماریزا این كار را انجام می دهند. انتخاب واریانتنوروتروپیك از 5 ژنوتیپH5N1/01 طی تكثیر در موش سریع به وقوع می پیوندد واریانتهای MB بسیار پاتوژن فقط طی یک پاساژ ویروس تولید می شوند. چنین انتخاب سریعی احتمالاًبوسیله اقامت طولانی غیر معمول این ویروسها در ششها امكان پذیرمی گردد. یافته ها دلالت می كند براینكه ارقام ژنهای داخلی در ویروسهی H5N1/97 كه از چرخه حیات بوسیله كشتار تمامی طیور در سال 1997 خارج شد.
فقط تركیب ژنها نبود كه منبع به پاتوژنسیته بالای این ویروس در طیور و پستاندران شد: قطعات مختلف چندتایی ژن داخلی ویروسها كه به طور رایج در جنوب شرقی چین در چرخه هستند می توانند كامل بكنند ژن HA ویروس شبه GO/Gd برای تولید ویروسهای كه بسیار بیماریزا هستند و در میزبان پستاندارخاصیت نوروتروپیک دارند. بنابراین HA ویروسهای شبه GO/Gd كه دارای سایتهای برشچندتایی هستند ممكن است یک نقش كلیدی را در بیماریزای ویروسهای مرغی H5N1 هنگ كنگیدر گونه های پستاندران فقط هنگامی كه بوسیله یک تركیب مناسب با ژنهای داخلی كامل شوند ایفا كنند.
ویروس ژنوتیپ A ازنظر داشتن ژنهای PA,M از رده فیلوژنیک شبه GO/Gd با ژنوتیپ B متفاوت است. ژنوتیپهای C حاوی ژنهای NP,BP1 از ویروسهای شبه GO/Gd است كه این ژنها ژنوتیپ C را از ژنوتیپ A,B متمایز می سازد.
ژنوتیپ های D,E فقط در ژن NP شان با همدیگر و با ژنوتیپ C فرق می كند ویروس ژنوتیپ B حاوی ژنهای HA,NA ای است كه از نظر فیلوژنی به ویروسهای شبه GO/Gd نزدیک می باشد این ژنها باعثمی شوند كه این ویروسها در رده پرندگان وحشی دریایی ناشناخته باقی بمانند. پیشنهاد می كنیم كه جمعیت ویروسی ژنوتیپ B هموژنوس می باشد. چرا كه هیچ واریانتبسیار پاتوژنی از این ژنوتیپ طی یک پاساژ در موش انتخاب نمی شوند. ژن HA از ویروسژنوتیپ B كه دارای سایتهای برش چندتایی كه از ویروسهای شبه GO/Gd منشاء گرفته اندبه تنهایی كافی نیستند. تا معرف یک ویروس با بیماری زایی بالا و نوروتروپیسم درموش حداقل طی یک پاساژ باشد .
در مقابل جمعیت ویروس ژنوتیپ B جمعیتهای ویروسیژنوتیپ های A,C,D,E هتروژنوس هستند چرا كه یک پاساژ از این ویروسها در موش منجر بهانتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن می شوند. مقایسه توالی ها بین واریانتهای MB و فتوتیپ ویروسهای H5N1/97 هنگ كنگی كه برای موش بسیار پاتوژن هستند و ویروسهایاداتپه شد. با موش هیچ گونه از سریهای معمول موتاسیونها را نشان نمی دهد .
فقطجانشین K به جای E627 در PB2 در واریانت MB ژنوتیپ C كه مشاهده شده مشابه موتاسیونبود كه مسئول بیماریزایی بالایی ویروس HK/483/97 بود اما این موتاسیون فقط در ویروسژنوتیپ C یافت می شد. فقدان یكسری موتاسیونهای رایج در واریانتهای بسیار پاتوژن ونوروتروپیک پیشنهادمی كندكه راههای مختلف زیادی برای ویروسهای آنفلونزای H5N1/01 هنگ كنگی برای دستیابی به بیماری بالاونوروتروپیسم در موش وجود دارد. شرط لازمبرای نوروویرولانس ویروسهای H5N1/01 هنگ كنگی درموش و انتخاب سریع فنوتیپ های بسیارپاتوژن در میزبان جدید ممكن است به دلیل شكل گیری ویژه كمپلكس ژنهای همانندساز باشد .
محلهای برش چندتایی درHA ضروری می باشد. اما برای اینكه این ویروسها رابسیار پاتوژن ونورو ویرلانت در موش باشد كافی نمی باشد، تغییرات اختصاصی در پروتئینهایPA,PB2 پلی مراز در این فرایند دخیل هستند بنابراین ما حدس می زنیم كهانتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن نوروتروپیك طی نوترتیبی طبیعی بوسیله بالا رفتنهتروژنسیته ویروسی از اضافه شدن ژنهای PA « ژنوتیپA و PB2 « ژنوتیپهای C,D,E» ازمنشاء شبه GO/Gd به زمینه كمپلكس همانند ساز از یک رده فیلوژنی دیگر تسهیل می شود.سوال در مورد ارتباط پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 هنگ كنگی در موش باتوانایشان دربیماریزای در انسان و دیگر گونه های پستانداران منطقی می باشد. لیكن انتخاب سریعواریانتهای نوروتروپیک درموش ارتباط نزدیكی با انتخاب سریع مشابه واریانتهایبیماریزا برای پستانداران دارد. تصمیم كشتار طیور در هنگ كنگ در سال 2001 یک راه مفید برای ریشه كنی این ویروسها و جلوگیری از انتخاب چنین واریانتهای بسیار پاتوژنیبود.

Accession توالیهای نوكلئوتیدی
توالیهای نوكلئوتیدی بدست آمده در این مطالعه در ژن بانک تحت شماره از Accession AY221592 تا AY221521 نگهداری می شود .

موادو روشها
جدا سازی ویروس وشناسایی آن :
بعد از شناسایی ویروس A/Goose/Guang/1/96 (GSGD/1/96) (H5N1)بعنوان یک پیش ساز مهم ویروس آنفولانزای هنگكنگی سال 1997 (HK/97) مراقبتهای روتین برای آنفولانزای مرغی توسط مسئولین درشهرهای Castol چین و استان های Guangdong , Guanxi,Fujian , Zhejiang , Shanghai شروع شد .
نمونه های كلوآک از اردكهای به ظاهر سالم مزارع گرفته شدند. ویروسها در جنین تخم مرغ همانطوری كه در رفرنس توضیح داده شده جداسازی شدند. تمام 21 ویروس H5N1 بوسیله تست های جلوگیری از هماگلوتیناسیون ( HI ) و نورآمینیداز « NI» با یکجدول آنتی سرمی كه بوسیله دفتر بین المللی آزمایشگاه رفرنس به نام Des Epizooties محدود در چنین اختصاصی _ بیماریزا و تخم مرغ آزاد بطور بیولوژیكی كلون گردید. تمامیآزمایشات با ویروسهای H5N1 جدا شده در یک سطح biosafety با امكانات 3 آزمایشگاه انجام گرفت و آزمایشات بر روی حیوانات در isolator های با هوای فیلتر شده و ضریب كارآیی بالا ( HEPA – filtered ) انجام گرفت.

آزمایش حیوانات، جوجه ها :برایتعیین پاتوژنسیته ویروسهای جدا شده شاخص بیماریزائی V 10 ( IVPI ) تست شد با توجهبه دستور كار دفتر بین المللی. DesEpizooties گروههای 10 تایی جوجه های سفید Leghorn ، 6 هفته و اختصاصی و عاری از عوامل پاتوژن در قفس های جدا كننده نگهداریشدند وبا 2/0 ml از یک رقت 10/1 مایع آلانتوئیک عاری از باكتری وحاوی ویروس بصورت 10 v مورد تلقیح قرار گرفتند.10 جوجه اضافی بطریقه داخل بینی ( x10 ) با 6 10( eID50 ) egg 50% infeetive dose از هر ویروس در یک طیف 1/0 ml مورد تلقیح قرار گرفتند، در روز سوم، 3 تا از جوجه های هر گروه تلف شدند ومیزان ویروس در نمونه های شش، bursa ، كلیه، تیموس، غده تیروئید، مغز، قلب، پانکراس، ماهیچه معده، طحال وتراكه تعیین تیتر گردید. تست های مشابه بر روی پرندگانی كه تلف شده بودند انجام شد. اینبافتها همچنین از نظر هیستوپاتولوژیكی مورد مطالعه قرا گرفتند، آنها در بافر خنثی محلول سیلین 10% فیكس شدند وبا هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند. نمونه های فیكس نشدهبرای عفونت زائی ویروس درجنین های تخم مرغ تیتر شدند.
موش : گروههای 8 تاییموش های ماده BALB 6 تا 8 هفته كمی با CO2 بیهوش شدند وبصورت n 10با 0.610 ( CID50) از ویروسهای آنفولانزای H5N1 در یك طیف 50 ml مورد تلقیح قرارگرفتند.
موش كنترل با PBS تلقیح شد. در روز 3 ، سه تا از 8 موش را برای تیتركردن میزان ویروس در شش ها، كلیه ها، طحال، و مغز كشته شدن. دوز حداقل كه 50% موشها را می كشد ( MLD50 ) بوسیله متد Muench , Reed محاسبه شد .
اردكها :گروههای 5 تایی از اردكهای 3 هفته بطریقه x10 با 85.7 10 تا 5.8 10 ( eIO50 ) از ویروس آنفولانزا در 1/0 ml مورد تلقیح شدند. اردكها روزانه برای 10 روز از نظربروز علائم بیماری تحت نظر گرفته شدند. نمونه های سوآپ كلوآک و oropharyngeal ازتمامی اردكها ، 3 و 5 روز بعد از تلقیح برای تیتراسیون ویروس در تخم ها جمع آوری شدند .
بررسی ژنتیكی وفیلوژنیكی : RNA ویروسی از مایعات آلانتوئیک بوسیله استفاده كیت RNeasy , Mini خالص سازی شدند و نسخه برداری معكوس شدند. تكثیر با PCR بوسیله استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات انجام گرفت. محصولات PCR با Kit خالصسازی QIA-quick PCR خالص سازی شدند و با استفاده از كیت Quick start – CEQDTCS برروی یک DNA سكوانسر CEQ8000 تعیین توالی شدند. اطلاعات مربوط به توالی هابا برنامه SEQMAN نوشته شدند و توالی های نوكلئوتیدی مقایسه شدند و درخت فیلوژنیک با برنامه MEGALIGN با استفاده از الگوریتم مسیر GLSTAL ساخته شد .
شماره Accession توالیهای نوكلئوتیدی : توالی های نوكلئوتیدی كه در این مطالعه به دست آمدند از ژن بانکبا شماره :
( accession nos . AY585357 – AY85524 )قابل دسترسی هستند .

نتایج :
بررسی آنتی ژنیكی : تستهای HI , NI با آنتی سرمهای رفرنس نشان داد كه هر یک از ویروسها تحت تیپهای H%N! می باشند. ویروسها دارایالگوی مشابه واكنش HI < NI هیچ گونه شواهدی دال بر دریفت آنتی ژنتیكی درویروسهای جدا شده از 1999 تا 2002 وجود ندارد بعنوان مثال تیترهای هترولوگوس HI كمتر از 4 بود – تا خوردگی كمتر از تیترهای هترولوگوس HI بود .
مطالعات در جوجه ها : ما از IVPI وروش پیشنهادی دفتر بین المللی Des Epizooties برای ارزیابی بیماریزایی ویروس در جوجه ها استفاده كردیم .
تمام جداشده ها، با این معیار بیماریزا بودند. لیكن یكی از آنها زودتر جدا شدند ( OKGX/07/99 ) فقط نیمی از جوجه هایی را كه به صورت V10تلقیح شده بودند كشتند. و میانگین زمان مرگ (MDT) دو تا از جدا شده های اولیه 8 روز بعد از تلقیح به صورت x 10 بود. ویروسهای H5N1 جدا شد در سال 2000 تنوع در MDT ( 807 تا 303 )بعد از تلقیح به صورت x 10 نشان دادند، در حالی كه نمونه های جدا شده در سالهای 2002 و2001 دارای MDT بین 7/1و4 بعد از تلقیح x 10 بودند ( تنها استثناد DKGX/53/02 بود كه یك MDT بیش تر از 5/6بود ).یک تمایل به زیاد شدن افزایش در IVPA در وقت اضافی وجود دارد. در 7 تا ازنمونه های جدا شده در 1999 و 2000 IVPA 3-9/2 بود. استثناء DKGX/53/02 بود كه IVPA آن 1/2 و MDT بیش تر از 5/6 روز داشت كه دال بر پاتوژنسیته خیلی كمتر می باشد،تمام جوجه هایی كه در روز 2و3 بعد از تلقیح مردند دارای جراحاتی بودند كه دلالت برهمانند سازی سیستمیک ویروس می كرد . آنها دارای نكروز متوسط بافت مغز، پنومونیشدید هیستوسایتیک همراه با ادم، نكروز حاد پانكراس، نكروز خفیف طحال، نفروزیس حادیا ضعیف و نكروز خفیف تا حاد بورسابودند. فقط شواهد مربوط به DKGX/07/99 دال برتكثیر غیر سیستمیک داشت.

مطالعات در موش :
بیشتر ویروسهای شدیداً پاتوژن آنفولانزای مرغی روسی جدا شده از سال 1997 قادر به تكثیر درپستانداران بودند. قبل از تست كردن بیماریزایی آنها در موش، بطور بیولوژیكی هرویروس جدا شده را بوسیله 3 چرخه محدود رقت در جنین های جوجه اختصاصی – بیماریزا و بدون جنین كلون قرار دادند .
هیچ پاساژ كوری در موش انجام نشد. اطلاعات از یکپاساژ x 10 در موش به دست آمده اند .
بر اساس توانایی تكثیر و قدرت كم كردن وزن و ایجاد مرگ و میر، ویروسهای H5N1 جدا شده به چهار گروه تقسیم شدند.هنگامی كه ویروس از هیچ ارگان موش 3 روز بعد از تلقیح با 6 10eID50 جدا نشد و هیچ كاهش وزنی و مرگ و میری در موش مشاهده نشد ویروس در موش غیر پاتوژن محسوب می شود. ویروسهایی كه می توانستند در موش تكثیر كنند بیشتر به گروههای پاتوژنسیته كم (LD506.5Log 10 eID50 M ) ، متوسط ( 3log10eID50 MLD50 6.5log10eID50 ) یا زیاد ( MLD 3log10eID50) ، بر اساس قدرت كشندگی شان در موش تقسیم بندی می شدند. گروههای غیر پاتوژن دارای 7 ویروس ( شامل GSGD/1/96) بودند كه در موش تكثیر نمی كردند و باعثكاهش وزن نیز نمی شدند، فقط یک ویروس ( DKGX/22/01 ) موجب تغییرات سرمی می شدند. گروه كم پاتوژن حاوی 4 ویروس بود كه با تیتر نسبتاً پایینی در ششها تكثیر می كردند،تمام این موشها تا روز 14 بعد از تلقیح دچار تغییرات سرمی شده بودند .
یکدوز بالا از این ویروسها ( eID50 بیشتر از 5.6 10 ) برای كشتن موش مورد نیاز بودتمام 7 ویروس در گروه با بیماریزائی متوسط در ششهای موش تكثیر پیدا كردند. سطحپایینی از دو ویروس در طحال تشخیص داده شد و یكی از ویروسهای جدا شده (DKSH/8/01 ) درسطح خیلی پائینی در مغز یافت شد. تمامی این ویروسها سبب عفونت كشنده در موش شدنداما دوز بالای ویروس ( eID50 6 10 تا 4 10 ) و طیف MLD50( از 407 تا ( 604log10eID50 مورد نیاز بود .
4
ویروس بسیار پاتوژن با تیتر بالائی در ششهای موش تكثیر می یابند و وجود ویروس در طحال، كلیه و مغز دال بر عفونت سیستمی; می باشد . MLD50 ویروسها در این گروه كمتر از (203log10eID50 ) بود .

ما یكافزایش سطح پاتوژنسیته برای موش را با پیشرفت زمان مشاهده كردیم:
ویروسهای جداشده در سال 1999 و 2000 برای موش كمتر بیماریزا بودند نسبت به آنهایی كه در سال 2000 و2002 جدا شدند، اگر چه یكی از ویروسهای جدا شده در سال 2000 ( DKGD/40/00 ) در گروه با بیماریزائی متوسط قرار داشت و یكی از ویروسهای جدا شده درسال 2002 ( DKGX/53/02 ) دارای بیماریزایی كم بود .

مطالعات در اردكها:
اردكهای وحشی میزبان طبیعی ویروسهای آنفولانزا هستند. تمام تحت تیپهای آنفولانزای مرغی ازاردكهای وحشی جدا شده اند و هیچ یک از آنها كه شامل تحت تیپهای بسیار پاتوژن H5,H7 نیز می باشند و هیچ سابقه تاریخی دال بر ایجاد بروز علائم یا مرگ در اردكها ندارند .
بطور غیر منتظره، ویروسهای H5N1 جدا شده از مرغابی های وحشی در هنگ كنگ درنوامبر 2002 سبب بیماری شدید عصبی شد و اردكها را هم در مزرعه و هم در آزمایشگاه كشت.گروههای 5 تایی اردكها را با 6 ویروس H5N1 كه نماینده ویروسهای مطالعه شده دراین تحقیق می باشند شامل 3 ویروس از زیر گروه بسیار پاتوژن در موش تلقیح كردند . « 5 تا از 6 ویروس H5N1 جدا شده در مرغابی ها همانند سازی كردند. آنهادارای ریزش ویروسی از تراكه یا كلوآک در سطح 2.0-403log10eID50/ml بودند . ویروسهادر اثر تماس پرندگان در ایزولاتور منتقل نشدند و هیچ یک از ویروسها سبب بروز علائم بیماری یا مرگ در اردكها نشد.
بررسی ملكولی وفیلوژنتیكی : برای تعیناساس ملكولی مشاهدات، تمامی ژنوم هر یک از 21 ویروس جدا شده تعیین توالی شدند. توالی ها با توالی های نماینده H5N1 شامل آنهایی كه از GSGD/1/96 و انواع انسانی جداشده از هنگ كنگ در سال 1997 HK/156/97 , HK/483/97 , HK/486/97 به دست آمده از بانکژنی مقایسه شدند. توالی های هماگلوتینین HA و نورآمیند از NA مربوط به ویروس A/duck/Anyang/av – 1/01(H5N1) ( DK/AY/01 ) جدا شده از گوشت اردكهای صادراتی ازچین به جنوب كره نیز مورد بررسی فیلوژنیكی قرار گرفتند.
ژنهای NA ویروسهای H5N1 جدا شده از ویروسها بیشتر به ژنهای (GSGD/1/96 96.4-9803% همولوژی ) نزدیك بودند تا ویروسهای جدا شده HK/97 ازیك شاخه جداگانه با NA هایی می باشد كه مااز اردكها جدا كردیمNA های ویروسهای جدا شده از اردكها به دو چنگال تقسیم میشدند كه DKGX/07/99 پایه وستون چنگال GSGD/1/96 , B1 پایه چنگال B2 می باشد. هر یکاز این چنگالها حاوی ویروسهای جدا شده از 2000 تا 2002 می باشد. DK/AY/01 در چنگالاز GSGD/1/96 مشتق می شود. بررسی توالی های آمینواسیدی بدست آمده نشان می دهد كهتمامی ویروسهای درچنگال كه از GSGD/1/96 مشتق می شوند دارای یک حذف 20 آمینواسیدیدر ساقه NA هستند ( بنیان 49 تا 68 )، در حالی كه خود GSGD/1/96 این طور نیست.این حذف در ساقه NA ، دارای فاصله اما هم پوشانی با حذف 19 آمینواسیدی یافت شد درویروسهای HK/97 جدا شده از انسانها می باشد. هیچ حذفی درویروسهای NA در چنگال مشتق شده از DKGX/07/00 وجود ندارد.
درخت فیلوژی ژنهای PA,PB1,PB2 از 22 ویروس H5N1 خیلی شبیه بودند .
c_e ویروسهایانسانی HK/97 جدا شده از یک شاخه مجزا بودند، در حالی كه ویروسهای جدا شده ازاردكها و GSGD/1/96 به دو چنگال اصلی كه در آن ویروسهایی كه جلوتر جدا شده اند بطورغالب در یک شاخه هستند تقسیم بندی می شوند. در درخت فیلوژنی PB2، ژنهای دو چنگالدر شاخه B سهم زیادی از همولوژی را داشتند و متعلق به یک خانواده می باشند.
به بیاندیگر، چنگالهای B1,B2 ژنهای PB1.PA دارای 93-90% همولوژی بودند ومی توان آنها را به عنوان خانواده متفاوتی در نظر گرفت.

درخت فیلوژنیک «NP » نوكلئوپروتئین متفاوت بود: ژنهای NP از 3 ویروس جدا شده از اردكها ( DKSH/35/02 , DKSH/38/01 , DKGX/50/01 ) یک شاخه جداگانه را تشكیل می دهند، درحالی كه HK/97 t NP انسانییک چنگال را تشكیل می دهد و دیگر H5N1 های جدا شده چنگالهای چندتایی را كه بازمان یا محل جغرافیشان مطابقت نمی كند تشكیل می دهند. درخت فیلوژنیکماتریكس » ژن دقیقاً مشابه با درخت ژنهای پلی مراز بود، اما M ژنهای DKGD/40/00 , DKFJ/19/00 درچنگال متفاوتی در شاخه B كه خودش به باقی مانده ها، شامل ویروسهای انسانی HK/97در آلل B مجزا می شدند.
4 ویروس اردكی وGSGD/1/96 در آلل A قرار داشتند، در حالی كه باقی مانده ها، شامل ویروسهای انسانی hk/97كه خودش به دوشاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند. در آلل B كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرارمی گرفتند . توالی های آمینواسیدی بدست آمده از تمام ویروسها در چنگال B1 از شاخه B در الل B دارای یک حذف 15-nt می باشد كه منجر به یک حذف 5 آمینو اسیدی در NS پروتئینمی شود. بر اساس تنوع ژنومیكی، ویروسها 9 ژنوتیپ را تشكیل میدهند.
این مسئله كه ژنهای مشابه PB2,HA,NA در ژنوتیپ های متفاوت یافت می شوند قابل ملاحظه می باشد. اتصال وارتباطقوی بین ژنوتیپ و یا فنوتیپ این ویروسها در موش وجود ندارد، درحالی كه مسیر واضح ازافزایش تصاعدی بیماریزایی این ویروسها در میان ژنوتیپهای مشابه، بخصوص ویروسهایژنوتیپ A,D دیده می شود.
DHSH/35/02 ,DKSH/38/01 در ژنوتیپ مشابه قرار دارند.اما DKSH/35/02 3 10 بار كشنده تر از DKSH/38/01 در موش می باشد.بیماریزایی متفاوت دو ویروس در ژنوتیپهای گروهی H,I بیشتر از به ترتیب 105X ,106 X می باشد . این نتایج پیشنهاد می كند كه موتاسیونهای بخصوص بیشتر از ساختار ژنومی ممكن است قدرت بیماریزایی آنها را تعیین سازد .

بحث :
این مطالعه شرح می دهد كه قبلاً جدا سازی ویروسهای آنفولانزای H5N1 تعیین خصوصیت نشدهاز اردكهای منطقه mainland چین از GSGD/1/96(H5N1) گزارششده اند. یافته های مانشان می دهند كه ویروسهای آنفولانزای بسیار بیماریزا از اردكهای به ظاهر سالم در استان Coastal چین ( بین Shanghai , Guandong ) از سال 1999 تا 2002 جدا شدند. اینویروس H5N1 جدا شده واكنش آنتی سرمی مشابه داشتند وژنهای HA آنها از نظر فیلوژنیكیهموژنوس بود. تمامی آنها به جز یكی سبب عفونت كشنده و وسیع سیستماتیک در جوجه هامی شدند و همگی دارای یک ردیف هایی از آمینواسیدهای پایه در محل برش HA بودند كه بابیماریزائی بالا همراه بود.
یافته ها مشخص كرد كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 درمیان اردكهای اهلی در چین از 1999 تا 2002 كه درچرخش هستند قادر به تكثیر در موش بوده و سبب عفونت سیستماتیک و مرگ بدون سازگار شدن در موش می شوند.
تعدادی ازمحققین گزارش كرده اند كه ویروسهای H5N1 جدا شده از انسان برای موش كشنده هستند.
فاكتورهایی زیادی گزارش شده اند كه با بیماریزائی H5N1 همراه می باشند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده كه بنیان 627 پروتئین PB2 یك نقش حیاتی در بیماریزائی H5N1 در موش دارد، همانطور كه داشتن ردیفهایی از آمینو اسیدهای اساسی در محل برش HA همین نقش را دارد. مطالعات دیگر نقش ژن NSوتوانائیش درتعدیل پاسخ سیتوكاینی رابازگو می كند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده اند كه بان 92 از ملكول NS1 از نمونه های ویروسهای (H5N1) A/HK/156/97 انسانی با القاء بیماریزائی شدید در خوكها همراهمی باشد. لیكن ، تمامی ویروسهای H5N1 اردكی دارای بنیان های آمینو اسیدی حفاظت شده GLV-627 در PB2,ASP-92,GLY-228 ( اعضای H3) در محل باند شدن بارسپتور می باشند.بنابراین ، این بنیانها ممكن است كه در همانند سازی های متفاوت و بیماریزائیویروسهای H5N1 اردكی در موش شركت نكنند. سوال مهمی كه باقی می ماند این است كه چگونه و چه وقت ویروسهای H5N1 توانایی تكثیر پستانداران را پیدا كردند.
نتایج نشان می دهد كه همانطور كه ویروسهای H5N1 در میان اردكهای اهلی در چرخش هستند، خصوصیاتی در آنها پدید می آید كه می توانند برای موش كشنده باشند. یكشرح احتمالی برای این یافته ها انتقال ویروسهای H5N1 از اردک به انسانها، تكاملانتخابی ویروسها در انسان ها و متعاقباً انتقال دوباره آنها به اردک می باشد. شواهدمحدود سرولوژیكی از عفونت زایی H5N1 انسانی وجود دارد همچنین شواهد محدودی نیزدرباره انتقال فرد به فرد ویروسهای H5N1 وجود دارد. شواهد در دسترس پیشنهاد می كندكه از سال 1997، ویروسهای آنفولانزای آسیایی باعث عفونتهای محدود كشنده یا حاد در انسانها می شوند، اما از انسان به انسان منتقل نمی شوند. انتقال بازگشتی ویروسهارا از انسانها به اردكها را به سختی می توان اثبات كرد، علی رغم وجود شواهدی كه درمورد انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی H9N2 از اردكها به دیگر طیور و سپس برگشت آنها به اردكها وجود دارد.
مسئله اساس ملكولی ویروسهای قابل انتقال به پستانداران حل نشده است. بطور عمده ژنهای چندتایی ویروسی، شامل HA دخیل هستند.تعدادی ساختارهای ژنهای مرغی چنین فرض می شود كه باعث انتقال به پستانداران میشوند. ویروسهای آنفولانزای H3N2كه در خوكها در سال 1997 در ایالت متحده وجود داشتهاند نوترتیبهای 3 تایی بودند كه حاوی قطعات ژنی از ویروسهای آنفولانزای مرغی،انسانی و خوكی بودند. این ویروسهای نوترتیب 3تایی H3N2 درمیان خوكها به میزان بسیاربالایی منتقل می شوند و در ایالت متحده انتشار وسیعی پیدا كردند.
به طور مشابه، ویروسهای آنفولانزای خوكیH1N1 كه بطور رایج در اروپا دارای انتشار وسیع هستندحاوی ژنهای ویروسهای آنفولانزای مرغی كه در سال 1999 یافت شدند می باشند. در نتیجه، ژنهای ویروس آنفولانزای مرغی، وقتی كه آنها قسمت عمده ای از ساختار ژنی باشند،به نظر می رسد كه بتوانند در میان گونه های پستانداران منتقل شوند. ارزیابی ژنوتیپهای مختلف ویروسهای H5N1 در اردكها ممكن است ساختار ژنهایی را كه سبب انتقالبه پستانداران می شوند روشن سازد .
احتمالات متفاوتی در مورد انتخاب خوک بعنوان میزبان وجود دارد.« وجود یک میزبان واسط ». در ناحیه ای از چین كه ویروسهایH5N1 آنها در این مطالعه تعیین خصوصیت شدند ، خوكها واردكها در كنار یكدیگر نگهداری میشوند خصوصاً در مزارع روستایی كه خانواده ها دارای تعداد كمی خوک واردک هستند. فرضیه كار ما این است كه ویروسهای H5N1 بتدریج توانایی تكثیر در پستانداران را ازطریق انتخابی كه تحت فشار رخ می دهد و همچنین احتمال انتقال بین خوكها واردكها پیدامی كنند. امروزه، هیچ گزارشی از جداسازی ویروسهای H5N1 از خوكها وجود ندارد، اگرچه خوكها بطور آزمایشگاهی باویروسهای H5N1 عفونی شده اند. ما اخیراً شواهد ویروسشناسی و سرولوژیكی از عفونت زائی ویروس H5N1 در خوكها دراستان Fvjian بدست آوردیم .
با این حقیقت كه یكی از ویروسهایی كه در اینجا مورد مطالعه قرار گرفتند قادربه ایجاد عفونت در اردكهای تلقیح شده نبودند با فرضیه ما هماهنگ نبودند و در اثرتماس با اردكها نیز منتقل نشدند. لیكن، تجربیات ازمایشگاهی بطور كامل وضعیت یك مزرعه را نمی تواند شبیه سازی كند، كه ممكن است شامل استرس و عفونت های همراه باچند باكتری یا ویروس باشد. بنابراین، انتشار ویروس در اثر تماس با اردک بهواحدهای ایزولاتور محدود می شود جایی كه مدفوعهای عفونی كننده حیوانات از طریق توریهای سیمی به درون محفظه ای می ریزد و ذخیره هوای HEPA فیلتر شده می باشد. لیكن،می توانیم از یافته هایمان چنین نتیجه گیری كنیم كه ویروسهای H5N1 جدا شده از مرغابیها در 2002 در این مطالعه برای اردكها بسیار كشنده نیستند، همانطوری كه ویروسهای H5N1 جدا شده از پرندگان وحشی آبی در نوامبر 2002 در هنگ كنگ این چنین بودند.جداسازی ویروسهای H5N1 كشنده جوجه ها از اردكهای به ظاهر سالم وجود ویروسهای H5N1 را در گوشت های مرغابی صادراتی به ژاپن و جنوب كره را توجیه می كند. لیكن، بررسی جزئیات ژنوتایپی 21 ویروسی كه ما جدا كردیم دال بر چرخش ویروسهایی در میان اردكهای منطقه mainland چین در سال 20002-1999 بود كه با ویروسهای H5N1 هنگ كنگی جدا شده ازفروشگاه های طیور زنده بوسیله GuaM فرق داشتند. ارتباط بین این ویروسهای H5N1 اردكیبا ویروسهای H5N1 جداشده از چین در 2004 بایستی تعیین گردد .
ژنهای HA,PB2 بنظرمی رسد كه یك نقش عمده را در تكثیر و بیماریزائی ویروسهای H5N1 در موش دارند. یافتهها دلالت بر این می كند كه ژنوتایپهای چندتایی ویروسهای آنفولانزای مرغی بطوربالقوه می توانند در پستانداران بیماریزا گردند. بطور مشخص، ویروسهای آنفولانزای H5N1 بطور مداوم در آسیا درحال ظاهر شدن هستند. مراقبتهای مداوم بهمراه تعیین جزئیات ساختارهای ژنی و تعیین بنیانهای اختصاصی ضرروی برای انتقال به پستانداران حیاتی می باشد .

سدهایی كه طیف میزبانی ویروس را تعیین می سازد :
به دلیل نقش HA در تشخیص سلولهای میزبان یكی از مهمترین عوامل تعیین كننده طیف میزبانهای ویروس آنفولانزا می باشد. رسپتورا اختصاصی ویروسهای آنفولانزای مختلف بستگی به حیوانات میزبانی دارد كه از آنها جدا شده اند.
ویروسهای آنفولانزای انسانی ترجیحاًسیالیل الیگوساكارید هایی را شناسایی می كنند كه در انتها دارای یک N استیل سیالیکاسید لینك شده با گالاكتوز بوسیله پیوند 6،2 هستند.( NevAc 2,6 Gal ) در حالی كه ویروسهای مرغی N استیل سیالیک اسید لینک شده با گالاكتوز را بوسیله پیوند 3و2شناسایی می كنند .
متقابلاً، غالب بودن باندهای سیالیک اسید گالاكتوز ازسیالیل الیگوساكاریدها در سلولهای اپیتلتال در محلهای همانند سازی ویروس بسته به نوع میزبان متفاوت است .
برای مثال، سلولهای اپیتلیال در تراكه انسان حاویبطور عمده NevAC2,6Gal است، در حالی كه در تراكه اسب و روده اردک « جایی كه ویروسهای مرغی تكثیرمی یابند » حاوی به طور عمده باندهای NevAC2,6Gal می باشد.
جالب است كه سلولهای اپی تلیال در تراكه خوک حاوی هم باندهای NevAC2,6Gal و هم NevAC2,3Gal می باشد كه این موضوع می تواند علت استعداد خیلی بالای این حیوان درابتلاء ویروسهای آنفولانزای انسانی و حیوانی شود.
در نتیجه ، اختصاصیت میزبان ویروسهای آنفولانزا می تواند تحت تاثیر میزان این دو نوع باندهای سیالیک اسیدگالاكتوز در سیالیل الیگوساكاریدها درسطح سلول باشد. حتی چنین تصور می شود كه درمیزان غالب بون سیالیل الیگوساكاریدها در محل همانند سازی ویروس های آنفولانزا دربین حیوانات میزبان مختلف فرق وجود داشته باشد .
بررسی ژنتیک تعیین میزبان اختصاصی از طریق كمپلكس همانند سازی / نسخه برداری ویروس آنفولانزای Aقطعات ژنوم ویروس مرغی نه تنها گلیكوپروتئین های سطحی را « HA ,NA » راكد میكند بلكه همچنین RNA , PB1 پلی مراز را نیز كد می كند.

موادوروشها :
كلون كردن ملكولی CDNAها :
RNALO ویروسی را از ویروسهای A/FPV/ROSTOCK/34 ، A/Mallard/NY/78 . A/Hong kong/156/97 (HK) رشد كرده بر رویجنین 11روزه تخم مرغ یا برروی سلولهای DMCK جمع آوری كردی CDNA ها طول كاملژنوم بوسیله نسخه برداری معكوس با استفاده از یک پرایمر مكمل pb12 حفاظت شده درانتهای 3 از هر قطعه ویروسی فراهم شدند و متعاقباً‌ با استقاده از پرایمرهای اختصاصی هر ژن PB1 , PB2 , PA , NP تكثیر شدند .
CDNA در رشته ای سپس در سایت ECORV ازحامل پلاسمیدی PHMG كلون گردید و توالی های آنها تعیین گردیدند. CDNA بدست آمده ازویروسهای A/PR/8/34(PR8) , A/Victoria /3/75(Victoria) بوسیله به ترتیب A.Portela , J.Pavlovic آماده شدند.

روش همانن سازی گذرا :پلاسمید Ppoli-cat-rt برای اجازه دادن به بیان یک نسخه ساختگی شبه RNA طراحی گردید. مخلوطی ازپلاسمیدهای Ppoli-cat-rt(1mg) , Phmg-pb1,pb2,pa,-np(1,1,1,2mg) به سلولهای cos-1 فرستاده شدند ، با استفاده از متد Fugen-Mediated بعد از 48 ساعت انكوباسیون در 37درجه سانتی گراد ، سلولها جمع آوری شدند و عصاره های سلولی برای فعالیت CAT تستشدند .

بحث :
نتایج ما باعث شناسایی آمینواسید 627 از PB2 بعنوان یک تعیین كننده عمده میزان كارآئی كمپلكس همانند سازی ویروس آنفولانزایA در سلولهای پستانداران ، با توجه به مشاهداتی كه قبلا از ویروسهای نوترتیب گزارش شده بود، شد .
كسب قطعه PB1 از ویروس آنفولانزای مرغی می توانست یک امتیاز انتخابی را به ویروسهای نوتیب مانند "آنهایی كه در پاندمی های 1968 و 1957 دخیل بودند اعضا میكند .
بر هم كنش های PB2-PA ,PB2-NP می توانست در ثبات كمپلكس همانند سازی دخیل باشد و بنابراین ممكن است باعث محدود تعدادی از وقابع نوترتیبی كه در تطابق قطعات ژنی دخیل هستند شود .
بعضی از خصوصیات ملكولی پروتئین های PB1,PB2,PA می توانست برای تعیین بیماریزائی ویروس A/HK/156/97 در انسانها اختصاصی باشد .
دمین های PB2 كه باعث توانایی ایجاد پلاک توسط ویروسهای آنفولانزای مرغی در رده ای از سلولهای پستانداران می گردد .
The underlying connection was closed: An unexpected error occurred on a send.
نظرات کاربران
ثبت نظر
نام شما
ایمیل شما
نظر شما
ارسال به دوستان
نام شما
ایمیل شما
ایمیل گیرنده
توضیحات
کد امنیتی
کد CAPTCHA
کدی که در زیر نمایش داده شده است را وارد نمایید
:                شبکه های اجتماعی پرشین پت را دنبال کنید 

face.jpg (205×206)   tw.jpg (204×224)pin.jpg (204×224)

10 خبر اخر سایت

◄ اسباب‌بازی‌های گهواره‌ای به شکل هیولا
◄ خانه گربه مدرن
◄ مبلی برای انها که گربه دارند
◄ مبل برای گربه ها
◄ بسته بندی عسل غیرمعمول
◄ مبلمان مدرن گربه‌پسند
◄ حیوانات خوردنی
◄ خانه گربه مدرن
◄ بسته بندی عسل
◄ گهواره ای برای گربه
◄ مبلمان مدرن گربه‌پسند
◄ دستگیره هایی شبیه به اختاپوس
◄ وشیدنی ساده به دم گربه‌ای
◄ کیف دستی خلاقانه ای که شبیه یک گربه
◄ Homer Simpson Backs Into Bushes
◄ خلال دندان جوجه تیغی
◄ جعبه گوسفندی برای گاموا
◄ جوجه تیغی جلیقه ای
◄ شامپو بچه لاستیکی اردک
◄ کفش‌های خلاقانه طراحی‌شده برای شبیه به دو موش
◄ ظرف کره ای جذاب با طرح نهنگ بازیگوش
◄ خرگوش های خرگوش واقعی
◄ کیف منحصر به فرد و جسورانه ای به شکل موش
◄ حیوان وحشی درونی خود را رها کنید
◄ قیچی آشپزخانه خلاقانه با دسته خفاشی
◄ کیف منحصر به فرد و جسورانه ای به شکل موش
◄ بلوک چاقوی خلاقانه
◄ کیف مدرسه مینیاتوری ژاپنی که برای سگ شما
◄ گلهای بازی قارچ خور
◄ دمپایی برگی
بعدی 1 قبلی

جدیدترین مقالات

◄ گدایی کردن در حیوان شما
◄ عقیم سازی
◄ جوش در سگ ها
◄ ورزش دادن گربه ها
◄ راهنمای کلی برای نگهداری از گربه
◄ کتامین
◄ كتاب(7)
◄ چه مواد غذایی برای سگ مفید است؟
◄ چگونگي نصب برنامه و ورود به برنامه
◄ فيبر ها
◄ انتخاب اسم برای سگ نر
◄ حالا من چی کار کنم ؟
◄ گربه های ناز نازی
◄ German Shorthaired Pointer
◄ فروش گربه پرشین کت
◄ فصل چهارم
◄ گربه و نازایی ! توهم یا واقعیت؟
◄ مهناز افشار و دلفین
◄ British Shorthairs
◄ ماهي و ماهي خور
◄ شباهت حيوانات
◄ اسباب‌بازی‌های گهواره‌ای به شکل هیولا
◄ Dog Fashion
◄ دکتر هومن و جراید
◄ انگل های داخلی در سگ ها
◄ معرفی دکتر شیری
◄ iهیولا ها
◄ قارچی معده در پرندگان
◄ پرورش لارو آناباتوئیدها (ترجمه)
◄ Metynnis Fasciatus
◄ شارک دم قرمز - Red Tailed Shark
◄ اپیلاتی دهان آتشی - firemouth epiplaty
◄ اطلاعات عمومی خانواده سیکلیده ها 2
◄ دراگون – Dragon
◄ مارماهی الکتریکی - electrophorus electricus
◄ سیچلاید های افریقایی
◄ اسب دریایی - Hippocampus
◄ جلبک ها اکواریوم های اب شیرین
◄ بخاری آکواریوم - Aquarium Heater
◄ انجماد اسپرم - How To Glaciation spermatozoon
◄ رفتار درماني براي سگها
◄ پولیوما ویروس در پرندگان
◄ تغذیه ایگوانا
◄ قیمت روز خودرو
◄ سگ پیتبول
◄ شی هوا هوا
◄ Belgian Sheepdog
◄ پیشینه سالوکی (تازی)
◄ رژیم غذایی مناسب برای مقابله با سوءهاضمه در اسب (ترجمه)
◄ راهنمای کلی برای نگهداری از سگ
◄ آموزش استفاده از جعبه خاک به خرگوش
◄ ایورمکتین در سگ ها
◄ گربه نژاد هیمالین
◄ تراریوم برای خزندگان
◄ غدای بچه گربه
◄ یازده سال اسارت سگ
◄ حقوق حیوانات از ۱۴ قرن قبل در اسلام مطرح شده است
◄ سگ در ایران باستان
◄ رفتار شناسي در حيوانات
◄ مردی که سگ همسایه اش را خورد+عکس
◄ Z
◄ بیضه ها
◄ انگل ژيارديا (اين تک سلولي خطرناک)
◄ "وگانیسم"
◄ عمر حیوانات چقدر است
◄ نگهداری از رتیل اوسامبارا بابون
◄ یوزپلنگ
◄ خرگوش به عنوان حیوان خانگی
◄ درماتوفیتوز (Dermatophytosis)
◄ کم خونی فقر آهن در گربه ها
◄ انواع مسمومیت های شیمیایی و غذایی در سگ
◄ حیوانات در برف
◄ زشت‌ترین سگ دنیا»
◄ پیراهنی برای عاشقان گربه
◄ نی نی های بامزه در لباس حیوانات
◄ پرشین پت نماینده انحصاری فربیلا در ایران
◄ چرا سگ ها به دنیال دم خود میگردند
◄ | German Wirehaired Pointer
◄ Redbone Coonhound
◄ Chinook
dram film izle